Comment préparer le gel d'acrylamide?
Pour de meilleurs résultats, préparez un nouveau lot de solution APS chaque fois que vous coulez un gel d'acrylamide.
Les gels d'acrylamide sont un élément clé de l'électrophorèse, un processus impliquant la séparation de différents types de molécules par taille. Ils se composent le plus souvent des composés chimiques acrylamide et bisacrylamide, ainsi qu'un tampon d'un pH approprié, une source de radicaux libres et un stabilisant spécial, qui sert à démarrer la polymérisation. Une fois qu'un gel a eu le temps de se solidifier, il peut être utilisé pour analyser l'ADN, l'ARN et diverses formations de protéines.
Partie 1 sur 3: mélanger un gel de résolution ou d'empilement
- 1Ajouter une quantité de base appropriée de ddh 2 o dans un flacon conique de 10 ml. Utilisez une pipette pour presser lentement la ddH 2 O dans votre flacon. Attention à ne pas ajouter plus ou moins que la quantité demandée par la recette que vous suivez, qui variera en fonction du format particulier (type de protéine) que vous comptez analyser.
- «ddH 2 O» est l'abréviation chimique de «double eau distillée», c'est-à-dire de l'eau qui a été purifiée à un niveau adapté aux applications de laboratoire sensibles.
- Pour faire un gel courant à 12%, par exemple, vous commenceriez avec 1650μl de ddH 2 O. Un microlitre (μl) est une très petite mesure de liquide qui équivaut à un millionième de litre.
- 2Suivi avec une concentration appropriée de sodium dodécyl sulfate (SDS). Utilisez une pipette propre et séparée pour transférer le SDS dans votre flacon de mélange. Le SDS «masquera» la charge intrinsèque de vos protéines de test, leur donnant à toutes un rapport charge/masse similaire. Lorsqu'un champ électrique est appliqué au gel, les différentes protéines migrent vers l'anode à des vitesses différentes en fonction de leur masse.
- Passez à une nouvelle pipette à chaque fois que vous ajoutez un nouveau composant au gel.
- 3Incorporer une solution d'acrylamide à 30%. Une solution d'acrylamide standard se compose d'isolats d'acrylamide infusés dans de l'eau ultra-pure. La solution d'acrylamide servira de matrice pour la séparation des protéines et des acides nucléiques.
- Si nécessaire, vous pouvez préparer votre propre solution à 30% en combinant 30% (w/v) d'acrylamide et 1,0% de N,N′-méthylène-bisacrylamide dans une concentration d'eau appropriée.
Avertissement: portez toujours des gants chaque fois que vous travaillez avec des mélanges d'acrylamide et de bisacrylamide. Les deux solutions sont des neurotoxines qui pourraient avoir de graves conséquences néfastes si elles étaient absorbées par la peau nue.
- 4Ajouter la quantité nécessaire de 1,5m tris-hci ph 8,8. Encore une fois, utilisez une nouvelle pipette et veillez à ajouter la quantité précise. L'ajout de Tris-HCI garantira que les composants entremêlés dans votre mélange de gel restent à un pH constant.
- Le Tris-HCI (abréviation de «chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane») est un type de tampon couramment utilisé dans les procédures et expériences chimiques.
- 5Infuser 10% de persulfate d'ammonium (APS). L'APS est un puissant agent oxydant fréquemment utilisé comme co-catalyseur dans la chimie des polymères. Avec TEMED, il est essentiel pour amorcer la polymérisation, un processus complexe de formation de liaisons qui entraînera la solidification du mélange liquide en un gel.
- Pour de meilleurs résultats, préparez un nouveau lot de solution APS chaque fois que vous coulez un gel d'acrylamide.
- 6Ajouter de la tétraméthyléthylènediamine (TEMED) en dernier pour catalyser la réaction. Une fois que vous avez terminé de rassembler le reste de vos composants, pressez le TEMED par-dessus. TEMED est le catalyseur principal utilisé en électrophorèse sur gel. Il démarrera la polymérisation dès qu'il entrera dans le mélange, alors soyez prêt à couler votre gel immédiatement après l'avoir ajouté.
- Il est essentiel d'ajouter la dernière TEMED, car il est responsable de la mise la réaction en mouvement.
- La procédure décrite ici (ainsi que l'ordre d'ajout) peut également être répétée pour préparer des gels d'empilement-la seule différence sera les quantités exactes de chaque composant.
Une solution d'acrylamide standard se compose d'isolats d'acrylamide infusés dans de l'eau ultra-pure.
Partie 2 sur 3: assemblage de l'appareil de coulée
- 1Placer la plaque mince sur la plaque épaisse et aligner les bords des deux plaques. L'électrophorèse sur gel est réalisée à l'intérieur d'un boîtier constitué de deux plaques de verre distinctes, dont l'une est légèrement plus épaisse que l'autre. Pour commencer à construire ce boîtier, empilez la plaque "courte" sur la plaque "haute" avec la plaque la plus mince sur le dessus.
- La plus épaisse des deux plaques comporte des entretoises intégrées qui créent une chambre étroite lorsqu'elle repose contre la plaque la plus mince.
- 2Faites glisser les plaques empilées dans la fente sur le dessus du cadre de coulée. La plaque courte doit faire face à la face avant du cadre, avec la plaque haute et les espaces visibles du côté opposé. Une fois que les plaques reposent bien à l'intérieur du cadre, faites pivoter les «portails» articulés de chaque côté du cadre vers l'arrière pour les maintenir en place.
- Assurez-vous que le bord inférieur formé par la paire de plaques alignées est parfaitement parallèle à la fois au bas du cadre de coulée et à la surface de travail sous-jacente.
- Le cadre de coulée est généralement moulé à partir de plastique vert, ce qui le rend instantanément distinguable du reste de l'appareil.
- 3Placez le cadre de coulée dans le corps du support de coulée. Soulevez la pince en forme de U sur le dessus du support, insérez le cadre avec la plaque courte tournée vers l'extérieur, puis abaissez-la à nouveau pour verrouiller le cadre. Testez la connexion entre les deux pièces pour confirmer que le cadre ne bouge pas ou ne bouge pas à l'intérieur du support.
- Une fois assemblés, il devrait y avoir juste assez d'espace entre les deux plaques pour injecter votre mélange de gel.
Astuce: Si vous le souhaitez, vous pouvez tester la chambre pour détecter d'éventuelles fuites en faisant passer environ 1 millilitre (0,034 fl oz) d'eau déminéralisée dans l'espace entre les plaques. Lorsque vous êtes satisfait, videz soigneusement l'eau ou glissez une feuille de papier filtre dans l'espace pour absorber l'excès de liquide.
La solution d'acrylamide servira de matrice pour la séparation des protéines et des acides nucléiques.
Partie 3 sur 3: verser votre gel
- 1Versez votre mélange de gel liquide dans l'ouverture en haut de la chambre. Utilisez une pipette en verre et une poire pour ajouter le mélange jusqu'à ce qu'il soit égal à la ligne de remplissage indiquée à l'extérieur du boîtier en verre. Ne vous inquiétez pas des bulles d'air que vous pourriez voir à l'intérieur du boîtier, vous les traiterez avant de laisser le gel polymériser complètement.
- Si l'équipement que vous utilisez ne comporte pas de ligne de remplissage, mesurez environ 1 centimètre (0,39 in) du haut de la "fenêtre" en verre visible à l'intérieur du cadre de coulée et faites une marque à l'aide d'un marqueur à feutre.
- 2Verser une couche d'alcool éthylique, d'isopropanol ou de n- butanol pour dégazer le mélange. Remplissez une nouvelle pipette avec l'alcool de votre choix et pressez-la petit à petit dans la chambre en utilisant un mouvement de va-et-vient fluide. Continuez à infuser l'alcool jusqu'à ce qu'il remplisse l'espace restant à l'intérieur du boîtier, environ 1 cm (0,39 in).
- Une solution de superposition d'alcool aidera non seulement à dissoudre l'oxygène piégé, mais empêchera également tout autre gaz de l'environnement de se frayer un chemin dans le mélange de gel fini.
- Il n'est généralement pas nécessaire de dégazer les gels empilés, car les couches séparées fonctionnent comme une matrice continue, permettant aux échantillons de protéines de migrer librement à travers le gel sous l'influence de l'électricité.
Alternative: Dégazez le mélange de gel liquide sous vide pendant au moins 15 à 20 minutes avant d'ajouter l'APS et le TEMED.
- 3Laisser le gel reposer pendant au moins 20 à 30 minutes à température ambiante. Maintenant, tout ce qu'il reste à faire est de régler une minuterie et de laisser votre gel reposer sans être dérangé pendant environ une demi-heure. Pendant ce temps, il finira de subir une polymérisation, durcissant progressivement en un gel dense.
- Évitez de déplacer, de bousculer, d'ajouter quoi que ce soit ou d'interférer de quelque manière que ce soit avec le gel pendant qu'il est en train de polymériser.
- Si le temps le permet, vous pouvez prolonger votre temps de polymérisation alloué à 45-60 minutes, juste pour être sûr que le gel a eu une chance de se solidifier complètement.
- 4Égoutter ou absorber la solution de superposition d'alcool une fois que votre gel a fini de prendre. Versez l'alcool dans un évier pour produits chimiques ou dans un réceptacle d'élimination des déchets liquides approprié, ou utilisez une feuille de papier filtre pour l'absorber. Vous avez maintenant la possibilité d'utiliser votre gel immédiatement ou de le stocker pour une analyse future.
- Certains chimistes recommandent également de rincer la surface supérieure du gel coulé avec une petite quantité d'eau déminéralisée.
- Les flacons Erlenmeyer sont également utiles pour mélanger des solutions et des gels d'acrylamide, car leurs cols coniques limitent la quantité de vapeurs potentiellement toxiques qui peuvent s'échapper.
- Assurez-vous que vos plaques de verre sont propres et exemptes de fissures, de copeaux ou d'autres dommages avant de commencer un moulage.
- Certains des risques associés au travail avec les acrylamides comprennent l'empoisonnement du système nerveux, des dommages ou des effets anormaux aux organes reproducteurs, une interférence avec la production d'hormones et un risque accru de cancer.
- De nombreux produits chimiques utilisés dans la préparation des gels d'électrophorèse sont caustiques à des degrés divers et peuvent provoquer une irritation légère à grave s'ils entrent en contact avec votre peau.
Si nécessaire, vous pouvez préparer votre propre solution à 30% en combinant 30% (w/v) d'acrylamide et 1,0% de N,N′-méthylène-bisacrylamide dans une concentration d'eau appropriée.
- Gel conique 10 ml ou erlenmeyer
- Pipette
- Gants en latex ou en nitrile
- ddH 2 O
- Dodécyl sulfate de sodium (SDS)
- Solution d'acrylamide à 30%
- 1,5M Tris-HCI pH 8,8
- Persulfate d'ammonium (APS)
- Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)
- Assiette courte
- Plaque d'espacement haute
- Moule de coulée
- Support de coulée
- Pipette et bulbe en verre
- Alcool éthylique, isopropanol ou n- butanol
- Minuteur
- Eau déminéralisée (facultatif)
- Papier filtre (facultatif)
- Marqueur feutre (facultatif)
